Πώς ξεχωρίζουν αυτές οι ενδονεσκέδες
Πόσα ξέρεις για τα ένζυμα περιορισμού; Γνωρίστε καλύτερα τι κάνουν και γιατί είναι σημαντικοί, με αυτή την κριτική.
Ορισμός των περιοριστικών ενζύμων
Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι μία κατηγορία ενζύμου που κόβει μόρια ϋΝΑ. Κάθε ένζυμο αναγνωρίζει μια μοναδική αλληλουχία νουκλεοτιδίων στον κλώνο DNA. Τέτοιες αλληλουχίες είναι συνήθως περίπου 4 έως 6 ζεύγη βάσεων. Οι αλληλουχίες είναι παλινδρομικές κατά το ότι ο συμπληρωματικός κλώνος DNA έχει την ίδια αλληλουχία μόνο στην αντίθετη κατεύθυνση.
Με άλλα λόγια, και οι δύο κλώνοι του DNA κόβονται στην ίδια θέση.
Πού βρίσκονται αυτά τα ένζυμα
Τα ένζυμα περιορισμού βρίσκονται σε πολλά διαφορετικά στελέχη βακτηριδίων όπου ο βιολογικός τους ρόλος είναι να συμμετέχουν στην κυτταρική άμυνα. Αυτά τα ένζυμα «περιορίζουν» το ξένο (π.χ. ιογενές) ϋΝΑ που εισέρχεται στο κύτταρο, καταστρέφοντάς το. Το κύτταρο-ξενιστής έχει ένα σύστημα τροποποίησης-περιορισμού το οποίο μεθυλιώνει το δικό του ϋΝΑ σε θέσεις ειδικές για τα αντίστοιχα ένζυμα περιορισμού, προστατεύοντάς το έτσι από τη διάσπαση. Έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 800 γνωστά ένζυμα που αναγνωρίζουν περισσότερες από 100 διαφορετικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων.
Χρήση στη βιοτεχνολογία
Τα ένζυμα περιορισμού χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για να κόψουν το DNA σε μικρότερους κλώνους προκειμένου να μελετήσουν τις διαφορές μήκους θραυσμάτων μεταξύ των ατόμων (πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού - RFLP). Χρησιμοποιούνται επίσης για κλωνοποίηση γονιδίων.
Οι τεχνικές RFLP έχουν χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσουν ότι άτομα ή ομάδες ατόμων έχουν διακριτικές διαφορές στις αλληλουχίες γονιδίων και πρότυπα διάσπασης περιορισμού σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος.
Η γνώση αυτών των μοναδικών περιοχών είναι η βάση για την αποτύπωση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA . Κάθε μια από αυτές τις μεθόδους εξαρτάται από τη χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης για διαχωρισμό των θραυσμάτων ϋΝΑ. Το ρυθμιστικό διάλυμα TBE, το οποίο αποτελείται από βάση Tris, βορικό οξύ και EDTA, χρησιμοποιείται συνήθως για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης για την εξέταση προϊόντων ϋΝΑ.
Τύποι περιοριστικών ενζύμων
Υπάρχουν τρία διαφορετικά είδη ενζύμων περιορισμού. Ο τύπος Ι κόβει το DNA σε τυχαίες θέσεις έως 1000 ή περισσότερα ζεύγη βάσεων από τη θέση αναγνώρισης. Ο τύπος III κόβεται σε περίπου 25 ζεύγη βάσεων από τη θέση. Οι τύποι Ι και ΙΙΙ απαιτούν ΑΤΡ και μπορεί να είναι μεγάλα ένζυμα με πολλαπλές υπομονάδες. Τα ένζυμα τύπου II, τα οποία χρησιμοποιούνται κυρίως στη βιοτεχνολογία, κόβουν το DNA εντός της αναγνωρισμένης αλληλουχίας χωρίς την ανάγκη για ΑΤΡ και είναι μικρότερα και απλούστερα.
Τα ένζυμα περιορισμού τύπου II ονομάζονται σύμφωνα με το βακτηριακό είδος από το οποίο απομονώνονται. Για παράδειγμα, το ένζυμο EcoRI απομονώθηκε από Ε. Coli . Το μεγαλύτερο μέρος του κοινού είναι εξοικειωμένο με τα κρούσματα Ε. Coli στα τρόφιμα.
Τα ένζυμα περιορισμού Τύπου II μπορούν να παράγουν δύο διαφορετικούς τύπους κομματιών ανάλογα με το αν κόβουν και τους δύο κλώνους στο κέντρο της αλληλουχίας αναγνώρισης ή κάθε κλώνο πιο κοντά στο ένα άκρο της αλληλουχίας αναγνώρισης.
Η προηγούμενη περικοπή θα δημιουργήσει "αμβλύ άκρα" χωρίς προεξοχές νουκλεοτιδίων. Ο τελευταίος δημιουργεί "κολλώδη" ή "συνεκτικά" άκρα επειδή κάθε προκύπτον θραύσμα του DNA έχει μια προεξοχή που συμπληρώνει τα άλλα θραύσματα. Και οι δύο είναι χρήσιμες στη μοριακή γενετική για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA και πρωτεϊνών.
Αυτή η μορφή DNA ξεχωρίζει γιατί παράγεται από την σύνδεση (συγκόλληση) δύο ή περισσοτέρων διαφορετικών κλώνων που δεν ήταν αρχικά συνδεδεμένα μεταξύ τους.