Η γονιδιακή κλωνοποίηση είναι η πράξη δημιουργίας αντιγράφων ή κλώνων ενός μόνο γονιδίου. Μόλις αναγνωριστεί ένα γονίδιο, οι κλώνοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε πολλούς τομείς βιοϊατρικής και βιομηχανικής έρευνας. Η γενετική μηχανική είναι η διαδικασία της κλωνοποίησης γονιδίων σε νέους οργανισμούς ή η αλλαγή της αλληλουχίας DNA για την αλλαγή του πρωτεϊνικού προϊόντος. Η γενετική μηχανική εξαρτάται από την ικανότητά μας να εκτελούμε τις ακόλουθες βασικές διαδικασίες.
01 αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης
02 Ένζυμα περιορισμού
Η ανακάλυψη ενζύμων γνωστών ως ενδονουκλεάσες περιορισμού ήταν απαραίτητη για την πρωτεϊνική μηχανική . Αυτά τα ένζυμα κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες θέσεις με βάση την ακολουθία νουκλεοτιδίων. Εκατοντάδες διαφορετικά ένζυμα περιορισμού , ικανά να κόβουν ϋΝΑ σε μια ξεχωριστή θέση, έχουν απομονωθεί από πολλά διαφορετικά στελέχη βακτηρίων. Το DNA που κόβεται με ένζυμο περιορισμού παράγει πολλά μικρότερα θραύσματα, διαφόρων μεγεθών. Αυτά μπορούν να διαχωριστούν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ή χρωματογραφία.
03 Ηλεκτροφόρηση
Ο καθαρισμός του DNA από μια κυτταρική καλλιέργεια ή η κοπή του χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού δεν θα ήταν πολύ χρήσιμο εάν δεν μπορούσαμε να απεικονίσουμε το DNA - δηλαδή να βρούμε έναν τρόπο να δούμε αν το εκχύλισμα σας περιέχει οτιδήποτε ή ποιο μέγεθος θραύσματα Έχω το κόψει. Ένας τρόπος για να γίνει αυτό είναι με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Τα πηκτώματα χρησιμοποιούνται για διάφορους σκοπούς, από την προβολή κομμένου DNA έως την ανίχνευση ένθετων DNA και knockouts.
04 Συμμετοχή σε δύο κομμάτια DNA
Στη γενετική έρευνα, είναι συχνά απαραίτητο να συνδέονται δύο ή περισσότεροι ξεχωριστοί κλώνοι DNA, να δημιουργείται ένας ανασυνδυασμένος κλώνος ή να κλείνεται ένας κυκλικός κλώνος που έχει κοπεί με περιοριστικά ένζυμα. Τα ένζυμα που ονομάζονται ϋΝΑ λιγάσες μπορούν να δημιουργήσουν ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ αλυσίδων νουκλεοτιδίων. Τα ένζυμα ϋΝΑ πολυμεράση Ι και πολυνουκλεοτιδική κινάση είναι επίσης σημαντικά σε αυτήν την διαδικασία για την πλήρωση των κενών ή τη φωσφορυλίωση των άκρων 5 ', αντίστοιχα.
05 Επιλογή μικρού αυτοαναπαραγόμενου DNA
Μικρά κυκλικά τεμάχια DNA που δεν αποτελούν μέρος βακτηριακού γονιδιώματος αλλά είναι ικανά αυτοαναδιπλασιασμού είναι γνωστά ως πλασμίδια. Τα πλασμίδια χρησιμοποιούνται συχνά ως φορείς για τη μεταφορά γονιδίων μεταξύ μικροοργανισμών. Στη βιοτεχνολογία, αφού το γονίδιο ενδιαφέροντος έχει ενισχυθεί και τόσο το γονίδιο όσο και το πλασμίδιο κόβονται με ένζυμα περιορισμού, συνδέονται μεταξύ τους δημιουργώντας αυτό που είναι γνωστό ως ανασυνδυασμένο DNA. Το ϋΝΑ του ιού (βακτηριοφάγου) μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως φορέας, όπως μπορούν και τα κοσμίδια, ανασυνδυασμένα πλασμίδια που περιέχουν γονίδια βακτηριοφάγου.
06 Μέθοδος για τη μετακίνηση ενός φορέα σε ένα κύτταρο υποδοχής
Η διαδικασία μεταφοράς γενετικού υλικού σε φορέα όπως πλασμίδιο σε νέα κύτταρα ξενιστή ονομάζεται μετασχηματισμός. Αυτή η τεχνική απαιτεί ότι τα κύτταρα-ξενιστές εκτίθενται σε μια περιβαλλοντική μεταβολή η οποία τους καθιστά "ικανούς" ή προσωρινά διαπερατές στον φορέα. Η ηλεκτροδιάτρηση είναι μια τέτοια τεχνική. Όσο μεγαλύτερο είναι το πλασμίδιο, τόσο μικρότερη είναι η απόδοση με την οποία απορροφάται από τα κύτταρα. Τα μεγαλύτερα τμήματα ϋΝΑ κλωνοποιούνται ευκολότερα χρησιμοποιώντας βακτηριοφάγους, ρετροϊούς ή άλλους ιικούς φορείς ή κοσμίδια σε μια μέθοδο που ονομάζεται μεταγωγή. Φάγοι ή ιικοί φορείς χρησιμοποιούνται συχνά στην αναγεννητική ιατρική, αλλά μπορούν να προκαλέσουν την εισαγωγή του DNA σε τμήματα των χρωμοσωμάτων μας, όπου δεν το θέλουμε, προκαλώντας επιπλοκές και ακόμη και καρκίνο.
07 Μέθοδοι επιλογής διαγονιδιακών οργανισμών
Δεν είναι όλα τα κύτταρα να καταλαμβάνουν το DNA κατά τη διάρκεια του μετασχηματισμού. Είναι σημαντικό να υπάρχει μια μέθοδος ανίχνευσης αυτών που κάνουν. Γενικά, τα πλασμίδια φέρουν γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά και διαγονιδιακά κύτταρα μπορούν να επιλεγούν με βάση την έκφραση αυτών των γονιδίων και την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μέσα που περιέχουν αυτό το αντιβιοτικό. Εναλλακτικές μέθοδοι επιλογής εξαρτώνται από την παρουσία άλλων πρωτεϊνών αναφοράς όπως είναι το σύστημα x-gal / lacZ ή η πράσινη πρωτεΐνη φθορισμού, οι οποίες επιτρέπουν την επιλογή με βάση το χρώμα και τον φθορισμό, αντίστοιχα.