Ο απαιτούμενος βαθμός καθαρότητας πρωτεΐνης εξαρτάται από την προοριζόμενη τελική χρήση της πρωτεΐνης.
Για ορισμένες εφαρμογές αρκεί ένα ακατέργαστο εκχύλισμα. Ωστόσο, για άλλες χρήσεις, όπως σε τρόφιμα και φαρμακευτικά προϊόντα, απαιτείται υψηλό επίπεδο καθαρότητας. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιούνται συνήθως αρκετές μέθοδοι καθαρισμού πρωτεϊνών, σε μία σειρά σταδίων καθαρισμού.
Κάθε στάδιο καθαρισμού πρωτεϊνών συνήθως έχει ως αποτέλεσμα κάποιο βαθμό απώλειας προϊόντος. Επομένως, μια ιδανική στρατηγική καθαρισμού πρωτεϊνών είναι αυτή στην οποία το υψηλότερο επίπεδο καθαρισμού επιτυγχάνεται στα λιγότερα στάδια. Η επιλογή των βημάτων που χρησιμοποιούνται εξαρτάται από το μέγεθος, το φορτίο, τη διαλυτότητα και άλλες ιδιότητες της πρωτεΐνης στόχου. Οι ακόλουθες τεχνικές είναι οι πλέον κατάλληλες για τον καθαρισμό μιας απλής κυτταρολυτικής πρωτεΐνης. Ο καθαρισμός των συμπλοκών κυτοσολικών πρωτεϊνών είναι πιο περίπλοκος και συνήθως απαιτεί την εφαρμογή διαφορετικών μεθόδων.
Πρώτα βήματα για τον καθαρισμό πρωτεϊνών
Το πρώτο βήμα στον καθαρισμό των ενδοκυτταρικών (εντός των κυττάρων) πρωτεϊνών είναι η παρασκευή ενός ακατέργαστου εκχυλίσματος .
Το εκχύλισμα θα περιέχει ένα πολύπλοκο μείγμα όλων των πρωτεϊνών από το κυτταρόπλασμα κυττάρων και μερικά πρόσθετα μακρομόρια, συμπαράγοντες και θρεπτικά συστατικά. Το ακατέργαστο εκχύλισμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ορισμένες εφαρμογές στη βιοτεχνολογία, ωστόσο, εάν η καθαρότητα είναι ένα ζήτημα, πρέπει να ακολουθούνται τα επόμενα βήματα καθαρισμού.
Τα εκχυλίσματα ακατέργαστης πρωτεΐνης παρασκευάζονται με απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων που παράγονται από τη λύση των κυττάρων, η οποία επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες και ένζυμα , υπερήχους ή γαλλικό Τύπο. Τα θραύσματα απομακρύνονται με φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο ανακτάται. Τα ακατέργαστα παρασκευάσματα εξωκυτταρικών πρωτεϊνών μπορούν να ληφθούν απλά με απομάκρυνση των κυττάρων με φυγοκέντρηση.
Για ορισμένες εφαρμογές βιοτεχνολογίας , υπάρχει ζήτηση για θερμοσταθερά ένζυμα : Ένζυμα που μπορούν να ανεχθούν υψηλές θερμοκρασίες χωρίς μετουσίωση και διατηρώντας παράλληλα υψηλή ειδική δραστηριότητα. Οι οργανισμοί που τις παράγουν καλούνται μερικές φορές εξωφθαλίσεις. Μια εύκολη προσέγγιση για τον καθαρισμό μιας ανθεκτικής στη θερμότητα πρωτεΐνη είναι η μετουσίωση των άλλων πρωτεϊνών στο μείγμα με θέρμανση και στη συνέχεια ψύξη του διαλύματος (επιτρέποντας έτσι στο θερμοσταθερό ένζυμο να μετατραπεί ή να αναδιαλυθεί εάν είναι απαραίτητο.) Οι μετουσιωμένες πρωτεΐνες μπορούν στη συνέχεια να απομακρυνθούν με φυγοκέντρηση.
Ενδιάμεσα στάδια καθαρισμού
Στο παρελθόν, ένα κοινό δεύτερο βήμα για τον καθαρισμό μιας πρωτεΐνης από ένα ακατέργαστο εκχύλισμα ήταν με καθίζηση σε ένα διάλυμα με υψηλή οσμωτική ισχύ (δηλαδή διαλύματα άλατος). Τα νουκλεϊκά οξέα στο ακατέργαστο εκχύλισμα μπορούν να απομακρυνθούν με καθίζηση συσσωματωμάτων που σχηματίζονται με θειική στρεπτομυκίνη ή θειική πρωταμίνη.
Η καθίζηση πρωτεΐνης συνήθως γίνεται χρησιμοποιώντας θειικό αμμώνιο ως άλας.
Διαφορετικές πρωτεΐνες θα καθιζάνουν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου . Γενικά, πρωτεΐνες με υψηλότερο μοριακό βάρος καθιζάνουν σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις θειικού αμμωνίου. Η καταβύθιση αλάτων δεν οδηγεί συνήθως σε υψηλή καθαρισμένη πρωτεΐνη αλλά μπορεί να βοηθήσει στην εξάλειψη ορισμένων ανεπιθύμητων πρωτεϊνών σε ένα μείγμα και στη συγκέντρωση του δείγματος. Τα άλατα στο διάλυμα στη συνέχεια απομακρύνονται με διαπίδυση μέσω σωλήνωσης πορώδους κυτταρίνης, διήθησης ή χρωματογραφίας αποκλεισμού πηκτής.
Τα σύγχρονα πρωτόκολλα βιοτεχνολογίας συχνά επωφελούνται από τα πολλά εμπορικά διαθέσιμα κιτ που παρέχουν έτοιμες λύσεις για τυποποιημένες διαδικασίες. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης συχνά εκτελείται χρησιμοποιώντας φίλτρα και στήλες διήθησης πηκτής. Το μόνο που έχετε να κάνετε είναι να ακολουθήσετε τις οδηγίες και να προσθέσετε τον σωστό όγκο της σωστής λύσης και να περιμένετε το καθορισμένο χρονικό διάστημα ενώ συλλέγετε το έκλουσμα (αυτό που βγαίνει από το άλλο άκρο της στήλης) σε ένα νέο δοκιμαστικό σωλήνα.
- Οι χρωματογραφικές μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν χρησιμοποιώντας στήλες κορυφής ή αυτοματοποιημένο εξοπλισμό HPLC. Ο διαχωρισμός με HPLC μπορεί να γίνει με μεθόδους αντίστροφης φάσης, ανταλλαγής ιόντων ή αποκλεισμού μεγέθους και δείγματα που ανιχνεύονται με συστοιχία διόδων ή τεχνολογία λέιζερ.
Οπτικοποίηση πρωτεϊνών και αξιολόγηση του καθαρισμού
- Η χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RPC) διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση τη σχετική υδροφοβικότητα τους . Αυτή η τεχνική είναι ιδιαίτερα επιλεκτική, αλλά απαιτεί τη χρήση οργανικών διαλυτών. Ορισμένες πρωτεΐνες μόνιμα μετουσιώνονται από διαλύτες και θα χάσουν τη λειτουργικότητά τους κατά τη διάρκεια της RPC. Συνεπώς, αυτή η μέθοδος δεν συνιστάται για όλες τις εφαρμογές, ιδιαίτερα εάν είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης στόχου.
- Η ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία αναφέρεται στον διαχωρισμό των πρωτεϊνών με βάση το φορτίο . Οι στήλες μπορούν είτε να προετοιμαστούν για ανταλλαγή ανιόντων είτε για ανταλλαγή κατιόντων. Οι στήλες ανταλλαγής ανιόντων περιέχουν σταθερή φάση με θετικό φορτίο που προσελκύει αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες. Οι στήλες ανταλλαγής κατιόντων είναι τα αντίστροφα, αρνητικά φορτισμένα σφαιρίδια που προσελκύουν θετικά φορτισμένες πρωτεΐνες. Η έκλουση της πρωτεΐνης στόχου πραγματοποιείται με αλλαγή του ρΗ στη στήλη, με αποτέλεσμα την αλλαγή ή εξουδετέρωση των φορτισμένων λειτουργικών ομάδων κάθε πρωτεΐνης.
- Η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους ( διήθηση πηκτής ) διαχωρίζει μεγαλύτερες πρωτεΐνες από μικρές, αφού τα μεγαλύτερα μόρια ταξιδεύουν ταχύτερα διαμέσου του σταυρωτά συνδεδεμένου πολυμερούς στη στήλη χρωματογραφίας. Οι μεγάλες πρωτεΐνες δεν ταιριάζουν στους πόρους του πολυμερούς ενώ οι μικρότερες πρωτεΐνες κάνουν και χρειάζονται περισσότερο χρόνο για να ταξιδέψουν μέσω της στήλης χρωματογραφίας μέσω της λιγότερο οδού τους. Το έκλουσμα συλλέγεται σε μια σειρά σωλήνων που διαχωρίζουν τις πρωτεΐνες με βάση τον χρόνο έκλουσης. Η διήθηση γέλης είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη συγκέντρωση ενός δείγματος πρωτεΐνης αφού η πρωτεΐνη στόχος συλλέγεται σε μικρότερο όγκο έκλουσης από ό, τι αρχικά προστέθηκε στη στήλη. Παρόμοιες τεχνικές φιλτραρίσματος θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν κατά την παραγωγή μεγάλης κλίμακας πρωτεϊνών λόγω της σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητάς τους.
- Η χρωματογραφία συγγενείας είναι μια πολύ χρήσιμη τεχνική για την "στίλβωση" ή την ολοκλήρωση της διαδικασίας καθαρισμού πρωτεϊνών. Τα σφαιρίδια στη στήλη χρωματογραφίας διασυνδέονται με συνδετήρες που δεσμεύονται ειδικά με την πρωτεΐνη στόχο. Η πρωτεΐνη στη συνέχεια απομακρύνεται από τη στήλη με έκπλυση με ένα διάλυμα που περιέχει ελεύθερους προσδέτες. Αυτή η μέθοδος δίνει τα καθαρότερα αποτελέσματα και την υψηλότερη ειδική δραστηριότητα σε σύγκριση με άλλες τεχνικές.
- Η δϋδ-ΡΑΟΕ είναι ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου, η οποία εκτελείται παρουσία SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο) το οποίο δεσμεύεται με πρωτεΐνες δίνοντας τους ένα μεγάλο καθαρό αρνητικό φορτίο. Δεδομένου ότι οι επιβαρύνσεις όλων των πρωτεϊνών είναι αρκετά ίσες, η μέθοδος αυτή τους χωρίζει σχεδόν εξ ολοκλήρου με βάση το μέγεθος. Η SDS-PAGE χρησιμοποιείται συχνά για να ελέγξει την καθαρότητα της πρωτεΐνης μετά από κάθε βήμα της σειράς. Καθώς οι ανεπιθύμητες πρωτεΐνες απομακρύνονται σταδιακά από το μείγμα, ο αριθμός των ζωνών που απεικονίζονται στην πηκτή SDS-PAGE μειώνεται, μέχρις ότου υπάρχει μόνο μία ζώνη που αντιπροσωπεύει την επιθυμητή πρωτεΐνη.
- Η ανοσοστύπωση είναι μια τεχνική απεικόνισης πρωτεΐνης που εφαρμόζεται σε συνδυασμό με χρωματογραφία συγγένειας. Τα αντισώματα για μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιούνται ως συνδέτες σε μια στήλη χρωματογραφίας συγγένειας. Η πρωτεΐνη στόχος διατηρείται στη στήλη, στη συνέχεια απομακρύνεται με έκπλυση της στήλης με διάλυμα άλατος ή άλλους παράγοντες. Αντισώματα που συνδέονται με ραδιενεργές ή βαφικές ετικέτες βοηθούν στην ανίχνευση της πρωτεΐνης στόχου μόλις διαχωριστεί από το υπόλοιπο του μίγματος.
Πηγές:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2η έκδοση. Macmillan Publishing Co., Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Handbook καθαρισμού πρωτεϊνών, έκδοση ΑΒ. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Νβνν Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.