Οι ηγέτες στην τεχνολογία μονού μορίου
Παρά τους περιορισμούς στην ευαισθησία, την ταχύτητα και το μέγεθος της ακολουθίας που μπορεί να επιτευχθεί, η νέα μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας που περιγράφεται στο PNAS ήταν νέα και έδειξε επαρκή υπόσχεση για να τραβήξει το βλέμμα των επιχειρηματικών κεφαλαίων που προσέγγισαν τον καθηγητή για την επένδυση στην τεχνολογία του. Πρέπει να υπήρχε κάτι σχετικά με την τεχνική που ήταν αυτό που οι επενδυτές επιχειρηματικών κεφαλαίων ψάχνουν καθώς αυτό ήταν το πρώτο , σύμφωνα με ένα μακρόχρονη υπάλληλο και Ανώτερος Διευθυντής Έρευνας, ο Δρ Timothy Harris ... οι επενδυτές venture συνήθως δεν πλησιάζουν οι επιστήμονες, είναι το αντίστροφο !
Η δημοσίευση του PNAS κυκλοφόρησε την 1η Απριλίου 2003, ο πρώτος γύρος χρηματοδότησης για μια νέα εταιρεία ξεκίνησε στις 19 Δεκεμβρίου 2003 και στις 2 Ιανουαρίου 2004 ο Helicos άνοιξε τις πόρτες του με 5 υπαλλήλους, συμπεριλαμβανομένου του Dr. Harris, ειδικός στην επιστήμη των μετρήσεων και στην τεχνολογία μονού μορίου. Η Helicos βρίσκεται αυτή τη στιγμή στο MA Cambridge, ΗΠΑ και μετά από 2 γύρους επενδυτικής χρηματοδότησης και από IPO στις 27 Μαΐου 2007, τώρα διατίθεται στο χρηματιστήριο υπό τη NASDAQ: HLCS .
Η Helicos ειδικεύεται στις τεχνολογίες γενετικής ανάλυσης, συγκεκριμένα μια τεχνολογία True Single-Molecule Sequencing (tSMS TM ) , επικυρωμένη με την αλληλουχία του γονιδιώματος του ιού M13 όπως περιγράφεται στο Science Magazine τον Απρίλιο του 2008. Η εξειδικευμένη πλατφόρμα tSMS TM χρησιμοποιεί το HeliScope TM Single Μοριακός διαχωριστής .
Σύμφωνα με τον Δρ Χάρις, το συγκεκριμένο έργο ξεκίνησε τον Ιανουάριο του 2004 και μέχρι τον Ιούνιο του 2005 είχαν επιτυχώς προσδιορίσει την αλληλουχία του ιού M13, μια ιατρικά σημαντική αλληλουχία, που περιγράφεται στο Science paper.
Πώς λειτουργεί το tSMS TM ;
Ένας κλώνος DNA περίπου 100-200 ζευγών βάσης κόβεται σε μικρότερα θραύσματα χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα και προστίθενται πολυΑ ουρές. Οι βραχύτεροι κλώνοι στη συνέχεια υβριδίζονται με την πλάκα κυττάρων ροής Helicos, η οποία έχει δεκάδες αλυσίδες πολυΤ συνδεδεμένες στην επιφάνεια της. Κάθε υβριδοποιημένο πρότυπο υποδιαιρείται σε μία αλληλουχία. Επομένως, τα δισεκατομμύρια ανά διαδρομή μπορούν να διαβαστούν. Η επισήμανση πραγματοποιείται σε τετράγωνα που αποτελούνται από 4 κύκλους έκαστο, για κάθε μία από τις 4 νουκλεοτιδικές βάσεις. Οι βάσεις που φέρουν σήμανση φθορισμού προστίθενται και ένα λέιζερ στο όργανο φωτίζει την ετικέτα, λαμβάνοντας μια ανάγνωση από ποια έλικα έχουν αναλάβει τη συγκεκριμένη ετικέτα με βάση. Η ετικέτα στη συνέχεια αποσπάται και ο επόμενος κύκλος ξεκινά με μια νέα βάση. Αφού το κύτταρο ροής έχει υποστεί επεξεργασία με κάθε βάση (4 κύκλοι), το quad είναι πλήρες και ένα νέο ξεκινά πάλι με την αρχική βάση νουκλεοτιδίων.
Επί του παρόντος, το HeliScope TM μπορεί να διαβάσει τμήματα DNA μήκους περίπου 55 ζευγών βάσεων. Όσο περισσότερες βάσεις στην ακολουθία, τόσο μικρότερο είναι το ποσοστό των κλώνων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ένα δείγμα, επειδή μερικές έλικες παύουν να επιμηκύνονται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας.
Για αναγνώσεις περίπου 20 βάσεων, μπορεί να χρησιμοποιηθεί περίπου το 86% των κλώνων. Για μεγαλύτερες αναγνώσεις (55+ ζεύγη βάσεων), αυτό το ποσοστό πέφτει στο 50% περίπου.
Το πλεονέκτημα του μονού μορίου
Ενώ αρκετές άλλες εταιρείες προσφέρουν διάφορες τεχνολογίες αλληλουχίας-σύνθεσης με πλατφόρμες υψηλής απόδοσης, διάφορα διαφορετικά αντιδραστήρια, με συγκρίσιμο κόστος και για σύντομες αναγνώσεις 25-40 ζευγών βάσεων, μόνο ο Helicos διαβάζει την ακολουθία DNA ένα νουκλεοτίδιο κάθε φορά με το πατενταρισμένο τεχνική σήμανσης που είναι αρκετά ευαίσθητη ώστε να επιτρέπει την ανάγνωση σε ένα μόνο μόριο. Άλλες μέθοδοι απαιτούν την ενίσχυση του DNA (χρησιμοποιώντας PCR ) για την παραγωγή πολλαπλών (εκατομμυρίων) αντιγράφων πριν από την αλληλούχιση. Εισάγει το δυναμικό για σημαντικό βαθμό ανακρίβειας λόγω σφαλμάτων επεξεργασίας από ένζυμα πολυμεράσης κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης.
Από τον Απρίλιο του 2008, το HeliScopeTM φέρεται να είναι ικανό να αλληλεπιδρά με δισεκατομμύρια νουκλεοτιδικές βάσεις ανά ημέρα.
Ο Helicos είναι μέλος του Συνασπισμού Εξατομικευμένης Ιατρικής και έχει λάβει επιχορήγηση "$ 1000 γονιδιώματος" . Το γονιδίωμα $ 1000 σε μια μέρα είναι ένας προβλεπόμενος στόχος που θα απαιτούσε από τον επεξεργαστή ακολουθίας να επεξεργάζεται δισεκατομμύρια βάσεις ανά ώρα. Επί του παρόντος, ο αρχικός προσδιοριστής ακολουθίας θα χρειαζόταν χρόνια για να προσδιορίσει ένα ολόκληρο γονιδίωμα, το οποίο θα κόστιζε πολύ περισσότερα από $ 1000.
Οι εφαρμογές για την τεχνολογία tSMSTM είναι πολλές, συμπεριλαμβανομένης της ανίχνευσης γενετικών παραλλαγών στον άνθρωπο και σε άλλα είδη για τον προσδιορισμό των αιτιών της νόσου, την ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά στα βακτήρια, τη βιωματικότητα των ιών και πολλά άλλα. Η ικανότητα ανίχνευσης ενός μόνο γονιδίου χωρίς ενίσχυση έχει πολλές πιθανές χρήσεις στην περιβαλλοντική μικροβιολογία, καθώς συχνά χρησιμοποιούνται γενετικές τεχνικές για την ανίχνευση βιώσιμων, μη καλλιεργούμενων μικροοργανισμών ή αυτών που βρίσκονται στο έδαφος και σε άλλες μήτρες που απαγορεύουν την απομόνωση με τις τρέχουσες μεθόδους. Επιπλέον, η φύση των περιβαλλοντικών δειγμάτων συχνά παρουσιάζει δυσκολίες στην ενίσχυση γονιδίων με PCR, λόγω προβλημάτων μόλυνσης. Ωστόσο, αυτές οι δυσκολίες θα πρέπει επίσης να ξεπεραστούν προκειμένου τα ένζυμα πολυμεράσης που χρησιμοποιούνται στο tSMSTM να λειτουργήσουν χωρίς παρεμβολή.
Η θεωρία πίσω από την αλληλουχία ενός μορίου είναι αρκετά βασική και ίσως να αναρωτηθείτε γιατί κανείς δεν το έχει σκεφτεί πριν. Παρόλο που ακούγεται αρκετά απλό, υπάρχουν πολλά τεχνικά στοιχεία που εμπλέκονται στην ανάπτυξη τέτοιων πλατφορμών και πολλές προκλήσεις για να κρατήσει τον Helicos απασχολημένο, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης νέων χημικών αντιδράσεων και αντιδραστηρίων, πλακών και συσκευών ανάγνωσης υψηλής απόδοσης. Η ικανότητα ανίχνευσης φθορισμού μίας μόνο ετικέτας σε μία μόνο βάση απαιτεί πολύ ευαίσθητα όργανα και η χημεία για σήμανση και ανίχνευση σημάτων πρέπει να είναι σωστή για να ελαχιστοποιηθεί η παρεμβολή και να βελτιστοποιηθεί η πιστότητα της ϋΝΑ πολυμεράσης καθώς εφαρμόζεται σε ακινητοποιημένα πρότυπα και επισημαίνεται νουκλεοτίδια. Αυτές είναι μερικές από τις προκλήσεις που αντιμετωπίζει ο Helicos, καθώς συνεχίζει να αναπτύσσει αυτή την τεχνολογία με την ελπίδα να παραδώσει κάποια στιγμή το ανθρώπινο γονιδίωμα των 1 δολ.